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Gelsenkirchen/Iserlohn/Siegen – 30. August 2015

Die WHO berichtet von einer weltweiten Zunahme sexuell übertragbarer Infektionen (STI) in den letzten Jahren. Die häufigsten bakteriellen STI Erreger sind Chlamydia trachomatis CT) und Neisseria gonorrhoeae (NG) mit einer Inzidenz von jeweils ca. 106 Millionen Fällen pro Jahr (1). Die aktuellen Daten des ECDC zeigen einen Anstieg der CT Infektionen in Europa von 191.000 im Jahr 2004 auf 385.000 im Jahr 2013 und der NG Infektionen von 34.000 auf 53.000 im gleichen Zeitraum. Die Daten von 2013 entsprechen einer Inzidenz von 181.8/100.000 bzw. 16.9/100.000 Einwohner (2). CT und NG Infektionen unterliegen in Deutschland nur im Bundesland Sachsen einer Meldepflicht. Die dort erhobenen Zahlen beschreiben ebenfalls eine Zunahme der Infektionen in den letzten 10 Jahren. 2011 betrug die Neuinfektionsrate von CT und NG Infektionen 95/100.000 Einwohner bzw. 13.7/100.000 Einwohner (3). Hochgerechnet auf ganz Deutschland ergibt sich eine Inzidenz von ca. 11.000 NG und 81.000 CT Infektionen. Die tatsächliche Anzahl liegt aber vermutlich höher, da viele Infektionen aufgrund des asymptomatischen Verlaufs nicht erfasst werden.  Im Gegensatz zu CT und NG sind Syphilis und HIV Infektionen in ganz Deutschland meldepflichtig. Die vom RKI erfassten Daten zeigen auch hier eine Zunahme der Neu-Infektionen in den letzten Jahren (Abbildung 1).

Abbildung 1: gemeldete HIV und Syphilis Infektionen in Deutschland 2001-2014, basierend auf den Daten des Robert-Koch-Instituts, Berlin

Die Zunahme der detektierten STI beruht auf verschiedenen Faktoren, die neben verändertem Sexualverhalten, mangelnder Prävention und die vermehrte Testung mit verbesserten Nachweisverfahren beinhalten. Insbesondere die Anwendung molekularbiologischer Techniken (Nukleinsäure-Amplifikationstests – NAATs) hat zu einer deutlichen Verbesserung der Sensitivität und Spezifität der STI Diagnostik geführt.

Aktuelle NAATs basieren meistens auf dem Prinzip der Polymerase Kettenreaktion (PCR) und verwenden Fluoreszenz-markierte Sonden, mit denen Amplifikationsprodukte bereits während der Reaktion (real time) detektiert werden können. Die Testdauer wird dadurch deutlich reduziert. In Kombination mit automatisierten Nukleinsäure-Extraktionssystemen können Ergebnisse heute innerhalb weniger Stunden generiert werden. Darüber hinaus ermöglichen real time PCR Analysen eine Quantifizierung der Erreger und die gleichzeitige Analyse mehrerer Erreger in sog. Multiplex Assays. Die hohe Leistungsfähigkeit molekularer Nachweisverfahren bedeutet aber nicht, dass klassische mikrobiologische Verfahren, wie die Kultur und Mikroskopie, oder serologische Methoden in der STI Diagnostik heute nicht mehr benötigt werden.

CT/NG Diagnostik

NAATs haben die höchste diagnostische Sensitivität zum Nachweis von CT und NG Infektionen (4,5), bei einer sehr hohen Spezifität, die der der Kultur entspricht. Sie gelten als Methode der Wahl in der diagnostischen Abklärung von CT Infektionen, sowie von NG Infektionen bei asymptomatischen Patienten (4,6). Dementsprechend bieten viele kommerzielle Hersteller sog. Duplex-Assays an, mit denen beide Erreger gleichzeitig nachgewiesen werden können.

Bei Männern ist die Sensitivität in Urethralabstrichen und Erststrahlurin vergleichbar, so dass Urin aufgrund der leichteren Gewinnung als Untersuchungsmaterial bevorzugt wird (7). Bei Frauen ist die Nachweisrate in Abstrichproben höher als im Urin (8). Daher sind für die NAAT Diagnostik bei Frauen vaginale, zervikale oder kombinierte zerviko-vaginale Abstriche besser geeignet (9). Kommerzielle NAATs sind für rektale und pharyngeale Abstrichproben zwar nicht zugelassen, werden aufgrund der im Vergleich zur Kultur höheren Empfindlichkeit aber auch für diese Proben empfohlen (6,10).

In vielen Vergleichsstudien findet sich eine hohe Übereinstimmung der Ergebnisse verschiedener NAAT (11,12). Gelegentlich abweichende Resultate sind auf die unterschiedliche analytische Sensitivität einzelner Tests, die Effizienz der Nukleinsäure-Isolierung und die Variabilität der Erreger zurückzuführen (13). Die Bedeutung der Variabilität der Chlamydien wurde durch die 2006 entdeckte schwedische Variante verdeutlicht, die infolge einer Deletion in der Zielregion einiger kommerzieller PCR Tests von diesen nicht mehr erfasst wurde (14). Genetische Veränderungen können zudem durch Rekombination von Genabschnitten auftreten, wenn Wirtszellen gleichzeitig mit mehr als einem Stamm infiziert sind (15,16). Eine wichtige diagnostische Verbesserung stellt die Implementierung einer zweiten Zielregion dar (dual-target assays), wodurch neu auftretende Varianten detektiert werden können, in denen eine der Zielregionen infolge von Deletionen oder Rekombinationen nicht mehr amplifiziert wird (17).

Die genomische Variabilität ist auch bei Gonokokken stark ausgeprägt. Der Verlust der Zielsequenz kann falsch negative Ergebnisse verursachen; falsch positive Ergebnisse können durch Kreuzreaktion mit apathogenen Neisserien auftreten. Aufgrund der natürlichen Kompetenz zur Transformation können kommensale Neisserien die DNA gleichzeitig anwesender Gonokokken aufnehmen (z.B. im Rachen) und in ihr Genom einbauen. Positive NAAT Ergebnisse in pharyngealen und rektalen Proben sollten daher mit einem zweiten Test bestätigt werden (6).

Ein Nachteil der molekularen Diagnostik besteht darin, dass bei positiven Befunden keine Aussagen zur Antibiotika-Resistenz möglich sind. Während für CT kaum Hinweise auf Resistenzen gegen antibiotische Substanzen vorliegen, hat die Suszeptibilitätstestung der Gonokokken im Hinblick auf die weltweite Zunahme von Resistenzen gegen zahlreiche Antibiotika, inkl. Cephalosporinen der dritten Generation, eine große Bedeutung (18). Bei klinischem Verdacht auf eine Gonorrhoe oder Nachweis einer Gonokokken-Infektion durch NAAT sollte daher immer versucht werden vor Therapiebeginn eine Kultur anzulegen und ggf. ein Antibiogramm zu erstellen. Resistenzdaten in Deutschland sind über das Gonokokken-Resistenz-Netzwerk (GORENET) verfügbar, das vom RKI in Zusammenarbeit mit dem Konsiliarlabor für Gonokokken gegründet wurde. In Tabelle 1 ist die Häufigkeit von Resistenzen bei Gonokokken-Stämmen angegeben, die 2014 in Deutschland isoliert wurden.

Da die Sensitivität der Kultur durch die begrenzte Lebensfähigkeit der Erreger außerhalb des Wirtsorganismus stark beeinträchtigt wird, ist die Entwicklung molekularer Methoden der Resistenztestung von großem Interesse. Für eine Reihe von Resistenzen sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bekannt, so dass der Nachweis entsprechender Resistenzdeterminanten durch molekulare Verfahren prinzipiell möglich ist (19). Zurzeit können diese Verfahren die kulturelle Analyse jedoch nicht ersetzen, da keine exakten MHK Werte bestimmt werden können und zudem eine große Anzahl verschiedener Resistenzdeterminanten berücksichtigt werden muss (18).

Serologische Methoden spielen in der Gonokokken Diagnostik keine Rolle. Sie sind ebenfalls nicht geeignet um akute, lokale CT Infektionen nachzuweisen, da die Antikörperantwort in der Regel erst nach mehreren Wochen nachweisbar wird. Bei chronischen und invasiven CT Infektionen (PID, LGV, reaktive Arthritis) können serologische Verfahren aber zur diagnostischen Abklärung beitragen. In diesen Fällen liegt in der Regel eine ausgeprägte Immunantwort vor, und die Erreger sind in Abstrichproben oftmals nicht mehr nachweisbar. Ein Problem der Interpretation Antikörper-positiver Befunde stellt die Kreuzreaktivität mit apathogenen Chlamydien dar. Eine Verbesserung der Chlamydien Serologie könnte durch die Verwendung immunogener Spezies-spezifischer Proteine erreicht werden. Bestimmte Antikörperkonstellationen sind möglicherweise auch als Marker für chronisch-invasive Infektionen geeignet (20).

Abbildung 2: Serologische Stufendiagnostik der Syphilis

Syphilis Diagnostik

Die Labor Diagnostik der Syphilis beruht primär auf serologischen Untersuchungen, die als Stufen-Diagnostik durchgeführt werden (21). Dazu wird zunächst ein Screening mittels TPHA, TPPA, EIA oder Chemilumineszenz-Immunoassay durchgeführt. Bei positivem Reaktionsausfall erfolgt eine Bestätigung, die mit dem FTA Abs Test oder Westernblot durchgeführt werden kann (ggf. auch TPHA, TPPA oder EIA, wenn diese nicht als Suchtest verwendet wurden), sowie die Bestimmung von IgM- und Lipoid-Antikörpern (VDRL, RPR) als Aktivitätsmarker (Abbildung 2).

  1. pallidum Antikörper sind in der Regel erst ca. 3 Wochen nach Infektionsbeginn nachweisbar. Bei negativem Suchtest ist in klinischen Verdachtsfällen daher zur Abklärung eine serologische Kontrolle erforderlich. Gegebenenfalls kommt auch der Direktnachweis durch Dunkelfeldmikroskopie (DFM) oder PCR in Betracht. Für die DFM sind Reizsekret aus dem Ulkus des Primaraffektes oder Abstrichmaterial aus nässenden Effloreszenzen des Sekundärstadiums geeignet, da hier in der Regel hohe Erregerkonzentrationen vorliegen. Abstriche aus der Mundhöhle und dem Rektum sind aufgrund der in diesen Proben häufig vorliegenden apathogenen Treponemen für die Mikroskopie nicht geeignet. PCR Analysen haben eine höhere Sensitivität als die DFM. Sie beträgt im Primär- und Sekundärstadium bis zu 95% bzw. 80% (21). Durch die Auswahl T. pallidum spezifischer Zielregionen besitzt die PCR eine sehr hohe Spezifität so dass auch orale und anorektale Proben analysiert werden können. Die PCR Analyse von Blutproben ist dagegen wenig aussagekräftig, da nur in einem kleineren Teil der Fälle Erreger DNA im Blut nachweisbar ist (22).

Schnelltests für die STI-Diagnostik

Neben einer hohen Testgenauigkeit ist die Dauer bis zur Befundmitteilung von großer Bedeutung in der STI Diagnostik. NAATs, kulturelle und serologische Analysen erfolgen in der Regel in einem zentralen Labor und erfordern daher einen Probentransport und eine Befundübermittlung an den Kliniker, die zu einer verzögerten Behandlung positiver Patienten führt. Unabhängig von diesen logistischen Anforderungen sind sog. Point-of-care (POC)-Tests, die an Ort und Stelle durchgeführt werden können und mit denen Ergebnisse innerhalb weniger Minuten vorliegen, so dass bei positiv getesteten Patienten unmittelbar therapeutische Maßnahmen eingeleitet werden können.

Inzwischen sind für nahezu alle STI Erreger Schnelltests verfügbar, die aber nur selten einer ordentlichen Testevaluation unterzogen wurden. Viele Schnelltests sind immunchromatographische Tests, die auf der Lateral Flow-Technologie basieren, dessen Prinzip in Abbildung 3 dargestellt ist. Schnelltests für CT und NG detektieren Antigene der Erreger in Abstrichproben oder Urin, haben aber eine im Vergleich zur Kultur und PCR deutlich niedrigere Sensitivität und Spezifität (23-25). Die systematische Evaluierung von Chlamydien Schnelltests im Rahmen des britischen HTA-Programms ergab, dass Schnelltests weder im Screening asymptomatischer Personen noch bei klinischen Verdachtsfällen für die Chlamydien-Diagnostik geeignet sind (25).

Mit einem molekularen Schnelltest (GeneXpert, Cepheid) ist die Untersuchung einzelner Proben auf Chlamydien und Gonokokken in ca. 90 Minuten möglich. Dieser PCR-basierte Schnelltest unterscheidet sich von Antigen-basierten Schnelltests in Bezug auf die diagnostische Genauigkeit und ist den Standard PCRs hinsichtlich Sensitivität und Spezifität nicht unterlegen (26). Damit bei positivem Testergebnis eine hohe Behandlungsrate erreicht wird, ist es aber erforderlich, dass die Patienten bereit sind 90 min zu warten. Weitere molekulare Schnelltests werden in Kürze verfügbar sein, mit denen Ergebnisse schneller vorliegen. Mit dem Io POC-Test Chlamydia von Atlas Genetics, der auf PCR in mikrofluiden Systemen und elektrochemischer Detektion der PCR Produkte basiert, sollen Ergebnisse in ca. 30 min vorliegen (27).

Abbildung 3: Prinzip des immunchromatographischen Schnelltests (Lateral Flow Assay)

Im Gegensatz zu CT und NG basieren Schnelltests für Syphilis und HIV üblicherweise auf dem Nachweis von Antikörpern, die in Gesamtblut, Plasma, Serum oder Kapillarblut aus der Fingerbeere bestimmt werden können (28,29). Entsprechend der aktuellen AWMF Leitlinie können POC-Tests für die Syphilis Diagnostik eingesetzt werden, wenn sie eine mit den konventionellen Suchtests vergleichbare Sensitivität und Spezifität haben (21). Probleme bei der Ergebnis-Interpretation ergeben sich durch die visuelle Auswertung. Schwach reaktive Banden, die zum Teil erst nach längerer Zeit sichtbar werden unterliegen einer stark subjektiven Bewertung. Des Weiteren ist bei positiver Reaktion keine Differenzierung zwischen abgelaufener und therapiebedürftiger Infektion möglich.

Mehrere CE-markierte und von der FDA zugelassene HIV-Schnelltests sind für die HIV Diagnostik gut geeignet. Sie haben eine hohe Sensitivität und Spezifität, die mit aktuellen Labortests (4. Generations-EIA) vergleichbar ist (28). Einige HIV-Schnelltests sind neben Blut auch für orale Flüssigkeiten zugelassen. Die Sensitivität ist in diesen Proben aber deutlich niedriger als in Blutproben (31). In der Frühphase der Infektion sind HIV-Schnelltests den serologischen Standardverfahren unterlegen, da sie meistens nur Antikörper, aber kein Antigen detektieren. Aber auch mit einem Combo-Schnelltest (Determine), der HIV Antikörper und p24-Antigen detektiert, waren akute Infektionen zu einem geringeren Anteil nachweisbar, als mit einem 4. Generations-EIA (Abbott Architect) (30). Ein negatives Schnelltestergebnis schließt eine frische HIV-Infektion daher nicht aus und erfordert ggf. eine Kontrolluntersuchung. Bei einem reaktiven Ergebnis ist, wie bei einem 4. Generations-EIA, die Bestätigung mit einem Standardtestverfahren erforderlich.

Seit 2015 sind auch zwei PCR-basierte HIV Schnelltests verfügbar. Der Test von Alere (qHIV 1/2 Detect) basiert auf einer Multiplex real time PCR mit der HIV 1, HIV 2 und Subtyp O in ca. 60 min. detektiert und differenziert werden können. In einer in Madagaskar bei Kindern HIV-positiver Mütter durchgeführten Studie erzielte der Test eine hohe Übereinstimmung (825/827 Proben) mit dem als Vergleichstest verwendeten Roche Cobas TaqMan Assay (32). Weitere CE-markierte PCR-Schnelltests sind für das GeneXpert System entwickelt worden, mit denen eine qualitative oder quantitative HIV-1 Bestimmung in ca. 90 Minuten durchgeführt werden kann. Nach Applikation der Probe wandert diese zunächst in das Konjugat-Feld. Dort werden Antigen-spezifische Goldnanopartikel-markierte Antikörper solubilisiert, die evtl. in der Probe vorhandene Antigene binden. Diese Immunkomplexe wandern im Chromatographiefeld weiter und werden von immobilisierten Antigen-spezifischen Antikörpern festgehalten. Ein zweiter Immobilisierter Antikörper der gegen konstante Regionen des Gold-markierten Antikörpers gerichtet ist dient als Kontroll-Antikörper. Die Bindung der Gold-markierten AK wird als rote Bande sichtbar (T: Testlinie, C: Kontroll-Linie).

Tabelle 1: Antibiotikaresistenzen bei Gonokokken in Deutschland (2014)

Anzahl sensibel intermediär resistent
Ceftriaxon 253 253 (100%) 0 (0%)
Cefixim 251 247 (98.4%) 4 (1.6%)
Azithromycin 253 129 (51.0%) 96 (37.9%) 28 (11.1%)
Penicillin 253 48 (19%) 128 (50.6%) 77 (30.4%)
Ciprofloxacin 253 68 (26.9%) 0 (0%) 185 (73.1%)

Die Analysen erfolgen im Rahmen des Gonokokken Resistenz Netzwerks (GORENET) an Stämmen, die 2014 in Deutschland isoliert wurden. Die Resistenztestung wurde mit E-Tests im Konsiliarlabor für Gonokokken (Vivantes Klinikum, Berlin-Neukölln) durchgeführt.

Interpretation nach EUCAST 4.0 (MHK-Werte in mg/L): Ceftriaxon: S ≤ 0.12, R > 0.12; Cefixim: S ≤ 0.12, R > 0.12; Azithromycin: S ≤ 0.25, R > 0.5; Penicillin: S ≤ 0.06, R > 1; Ciprofloxacin: S ≤ 0.03; R > 0.06

Autor: Thomas Meyer, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Virologie und Hygiene, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE); th.meyer@uke.de (im Jahr 2015)

Referenzen

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